Волновое воздействие на клетки зараженные вирусом   имуннодефицита.

И.А.Горшков
Г.В. Корнилаева
В.Н. Тюняев

В группе иммунохимии Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН проводились исследования по изучению антивирусного эффекта при воздействии устройства Лотос (пассивной переизлучающей антенны) на ВИЧ-инфекцию in vitro. С целью оптимизации условий воздействия и достижения максимального эффекта во второй серии экспериментов было предпринято многократное воздействие устройства на зараженные клетки по 30 минут при комнатной температуре 3 раза в неделю с интервалом 1 день на протяжении всего срока наблюдения (от 10 до 25 суток в зависимости от задач эксперимента). Исследования проводились по следующим направлениям.
I. Изучение влияния устройства Лотос на продукцию вируса хронически зараженными клеточными культурами.
Ранее нами было показано, что однократное воздействие устройства не оказывает заметного влияния на продукцию вируса хронически зараженными клетками линий-продуцентов СЕМ/Bru и СЕМ/ПЕВ. Характеристика и условия культивирования этих линий описаны в отчете. Во второй серии экспериментов была поставлена задача исследовать уровень вирусной продукции при многократном воздействии устройства Лотос на протяжении более длительного срока (25дней) культивирования. Перед воздействием клетки линий-продуцентов СЕМ/Bru и СЕМ/Т Т ТВ отмывали центрифугирова­нием при 1000 об/мин 7 минут и ресуспендировали в свежей ростовой среде с концентрацией 0,3x106 в мл (подсчет клеток проводили в камере Горяева). В объеме 1,5 мл клеточную суспензию помещали в лунки 24-луночного планшета и подвергали первичному воздействию устройства. Все последующие воздействия проводились по схеме, описанной выше. С контрольными образцами поступали аналогично (за исключением воздействия устройства). Каждые 3-4 дня из лунок отбирали пробы вируссодержащей жидкости для определения вирусного антигена методом ИФА (анти-р24, Innogenetics, Бельгия). С той же периодичностью, для поддержания оптимальной концентрации в объеме лунки, клетки рассевали 1:3, заменяя использованную ростовую среду на свежую. Таким образом, было проведено 7 пассажей с 9-разовым воздействием устройства Лотос.
Для более точной оценки количества продуцируемого клетками вируса образцы вируссодержащей культуральной жидкости были тестированы в ИФА в разведениях 1:3; 1:9; 1:27; 1:81 и 1:243. Результаты исследований по 2 линиям-продуцентам представлены в таблицах 1А и 1Б. Сравнительный анализ контрольных и опытных образцов показал, что под влиянием устройства независимо от номера пассажа в опытных вариантах титр вируса снижается примерно в 3 раза Так, в контрольных пробах титр вируса, продуцируемого клетками СЕМ/Bru был не ниже 1:81 (IY пассаж) и 1:243 (YII пассаж). Тогда как в соответствующих опытных вариантах титр вируса составлял 1:27 (IY пассаж) и 1:81(YII пассаж). Сравнивая вирусную продукцию в контрольных и опытных образцах линии-продуцента CEM/IIIB, можно также наблюдать тенденцию к снижению, однако менее выраженную.
Это хотя и незначительное, но достоверное снижение вирусной продукции в хронически зараженной культуре клеток может быть результатом либо вирулицидного действия устройства на внеклеточный вирус, что приводит к снижению возможной реинфекции, либо воздействие изменяет некие внутриклеточные процессы, влияющие, например на пролиферативную активность клеток и, следовательно, на продукцию вируса.
Кроме того, следует принять во внимание тот факт, что необходимость рассева клеток каждые 3-4 дня приводит к тому, что популяция клеток в процессе деления постоянно обновляется, при этом лишь незначительная часть их к концу эксперимента могла быть подвержена 9-кратному воздейст­вию устройства. Основная же часть клеток в среднем испытывала от 4 до 5 воздействий.
П. Влияние устройства Лотос на способность клеток заражаться ВИЧ.
Отмытые и ресуспендированные в свежей среде клетки СЕМ в концентрации 0,3x106 в мл помещали в лунки 24-луночного планшета в объеме 1,5 мл и подвергали воздействию устройства Лотос. Далее клетоки заражали штаммами вируса ВИЧ-1/Bra и ВИЧ-1 ЛИВ с множественностью инфекции 0,02 и 0,1 соответственно. В последующие дни воздействие проводилось 3 раза в неделю с интервалом 1 день по 30 минут. За развитием инфекции наблюдали в течение 10 суток, оценивая при микроскопировании цитопатическое действие (ЦПД), выражающееся в клеточной гибели и синцитиеобразовании. Каждые 3-4 дня во время замены 1/2 объема среды из лунок отбирали пробы для последующего определения концентрации вирусного антигена с помощью ИФА.
Согласно визуальным наблюдениям инфекция развивалась как в контрольных, так и в опытных вариантах, с характерным для ВИЧ-инфекции признаками ЦПД в виде клеточной гибели и синцитиеобразования. В опытных вариантах как в случае инфекции ВИЧ-1/Bra, так и в случае инфекции ВИЧ-1/ШВ наблюдалась несколько большая гибель клеток. К 10 суткам инфекции во всех образцах ЦПД достигал максимального проявления, оцениваемого, как +3,5-4. Проведенный затем иммуноферментный анализ образцов, отобранных на 4 и 10 сутки инфекции, показал, что и в опытных и в контрольных клетках инфекция развивается достаточно эффективно, обнаруживая уже к 4 суткам высокий уровень вирусного антигена в культуральной жидкости (Таблица 2). Применение вышеописанного способа титрования образцов позволило обнаружить некоторые различия в количестве продуцируемого вируса в контрольных и опытных клетках (Таблица 3). Так, к 10 суткам, когда инфекция достигает максимального развития титр вируса в опытном образце не менее, чем в 3 раза ниже по сравнению с контрольным.
Для того, чтобы установить, обладает ли вирусное потомство, выращенное в опытных и контрольных клетках, одинаковой биологической активностью, свежие клетки СЕМ заражали вируссодержащей жидкостью от 10-суточной инфекции (множественность заражения 0,02). По истечении 4 суток «новой» инфекции, как показывают результаты ИФА (табл. 4), вирусное потомство из обработанных клеток (опытный вариант) обнаруживает несколько сниженную вирулентность (в 3 раза при титре 1:81). При дальнейшем культивировании зараженных клеток (до 7 суток) продукция вируса становится столь значительной, что в разведении 1:81 обнаружить различия между опытным и контрольным вариантами не удается.
Ш. Влияние устройства Лотос на репликацию ВИЧ.
Клетки СЕМ в концентрации 0,3*106 в мл в объеме 1,5 мл вносили в 24-луночный планшеты и заражали референс-штаммами ВИЧ1BRU и ВИЧ1ШВ с различной множественностью инфекции (0,1; 0,01 и 0,001). Зараженные клетки сразу же подвергались воздействию устройства Лотос 30 мин при комнатной температуре, а в последующие дни инфекции в режиме, описанном выше. Наблюдение за развитием инфекции проводили как описано в пункте II. При визуальном наблюдении вирусиндуцированного цитопатического эффекта была отмечена несколько большая гибель клеток в опытных вариантах CEM:BRU и СЕМ:ШВ, особенно четко проявлявшаяся при м.з. 0,01 к 7 суткам.
Согласно данным ИФА (р24) к 4 и тем более к 10 суткам репликация вируса достигает существенного уровня и в контрольных и в опытных вариантах (табл. 5). Дальнейшее титрование образцов жидкости, полученной от инфекции CEM:BRU с множественностью заражения 0,01 на 4 и 10 сутки показывает, что при 2-кратном воздействии устройства (4 суток) репликация вируса несколько ниже по сравнению с контрольным вариантом. К 10 суткам наблюдаемый эффект нивелируется и в пределах указанных разведении образцов не определяется (табл. 6).
IV.   Влияние   устройства  Лотос   на   биологическую   активность вирусного потомства.
Для оценки биологической активности вирусного потомства вирус-     содержащую жидкость 10-суточной инфекции CEM:BRU (0,01) (4-кратное воздействие) использовали для заражения «свежих.» клеток СЕМ с м.з. 0,01 (см. рис.1). Визуальные наблюдения показали следующее: начиная с 3 суток от начала инфекции в пробах, зараженных контрольными образцами, обнаруживается существенно большее количество синцитиев. Для сравнения на 4 сутки в пробе, зараженной контрольным образцом вируссодержащей жидкости (от м.з. 0,01) обнаруживается множество синцитиев, тогда как в аналогичной пробе опытного образца синцитии к этому сроку отсутствуют совсем. Более высокий цитопатический эффект свидетельствует о более активной инфекции.
По результатам ИФА (4 сутки новой инфекции) вирулентность вирусного потомства, полученного в опытном варианте заметно ниже (~ в 10 раз) в сравнении с контрольным (табл. 7). К 7 суткам активная инфекция наблюдается как в контрольном, так и в опытном образцах параллельно при визуальной оценке и по результатам ИФА, показывающим, что определить каких-либо различий не удается.
Полученные данные свидетельствуют о том, что вирусное потомство из опытных образцов обладает пониженной репликативной активностью. Это можно объяснить либо снижением количества образующихся вирусных частиц в процессе воздействия устройства Лотос, либо образованием большого числа дефектных частиц. Какова бы ни была причина тем не менее следует отметить, что активная часть вирусного потомства с нормальными репликативными свойствами, способная вызывать активную инфекцию, сохраняется в популяции.
IV.   Влияние   устройства   на   синцитиеобразуюшую   способность зараженных клеток.
Клетки от 10 суточной инфекции (рис. 1) сокультивировали с незараженными клетками Sup-Tl (концентрация 0,5*106 клеток в мл) в соотношении 1:2. По истечении 48 часов проводили подсчет синцитиев в лунках под микроскопом. За синцитий принимали структуру с диаметром, превышающим 3 и более диаметров нормальной клетки. Результаты этих экспериментов представлены в табл. 8.
Полученные данные отчетливо показывают, что зараженные клетки опытных образцов обладают гораздо меньшей способностью образовывать синцитии при сокультивации с незараженными клетками Sup-Tl. При этом, чем меньше была исходная доза заражения (0,01 и 0,001), тем меньшее число клеток после 10 суток инфекции способно соединяться с незараженными клетками. Это наблюдается как в случае ВИЧ1Вки инфекции, так и в случае ВИЧ1 ШВ-инфекции.
Процесс вирусиндуцированного синцитиеобразования основан на взаимодействии вирусных гликопротеинов gpl20/gp41, экспонированных на поверхности зараженной клетки со специфическими рецепторами и корецепторами незараженной клетки CD4, CXCR4 (и др.), приводящим к слиянию клеточных мембран и образованию гигантских многоядерных структур, хорошо различимых под микроскопом.
Обнаруженные нами различия в синцитиеобразующей способности зараженных клеток контрольных и опытных образцов могу иметь в основе разные причины, как например:


1)  содержание меньшего числа зараженных клеток с экспонированными вирусными гликопротеинами в популяции после 10 суточного культивирования;
2)   повреждение рецепторного (и/или фузионного) сайга поверхностных вирусных гликопротеинов в результате воздействия устройства Лотос.

На основании проведенных исследовании было установлено:
1)  Устройство Лотос снижает продукцию вируса в хронически зараженных клеточных культурах. Несмотря на то, что обнаруженное антивирусное действие невысоко (обнаруживается только при титровании вируссодер-жащего материала), тем не менее, этот факт заслуживает внимания потому, что подавление хронической инфекции является весьма трудной задачей.
2)   Вторая серия экспериментов обнаруживает повторяемость выявленных ранее закономерностей, а именно, снижение репродукции вируса в клетках предобработанных перед заражением или при воздействии устройства сразу же после заражения клеток вирусом.
3)    Предпринятая попытка усилить антивирусный эффект путем многоразо­вого воздействия устройства Лотос не дала ожидаемого результата. По-видимому в силу достаточно высокой пролиферативной активности используемых для заражения клеток, нельзя считать, что все клетки зараженной популяции испытывали многоразовое воздействие.
4)    Более ощутимый ингибирующий эффект от воздействия устройства наблюдается при исследовании биологической активности вирусного потомства. При этом титр вируса снижается не менее, чем в 10 раз.
5)    Значительное подавление синцитиеобразующей способности клеток дает основания сделать предположение о влиянии устройства на рецепторно-фузионные сайты вирусных гликопротеинов.


Таблица 1(А).

Изучение влияния устройства «Лотос» на вирусную   продукцию   в  хронически инфицированных культурах клеток CEM/Bru (А) и СЕМ/ШВ (Б).

(А) - линия-продуцент CEM/Bru

1 пассаж

Образцы

б\р*

1:3

1:9

1:27

1:81

Контроль1

2,538"

2,350

2,197

2,070

1,471

Опыт2

2,51

2,298

2,245

2,122

1,290 (85.8%)

IV пассаж

Контроль

2,1514

2,33

2,197

2,025

1,25

Опыт

2,4727

2,149

1,989

1,013 (44.5%)

0,397 (18.3%)

VII пассаж

Контроль

2,502

2,35

2,233

2,184

1,819

Опыт

2,39

2,298

2,255

2,114

1,588 (85.7%)

VII пассаж

 

1:3

1:9

1:27

1:81

1:243

Контроль

 

 

2,064

1,915

1,170

Опыт

 

 

1,853

1,116

0,482

1. - Контроль - клетки линии CEM/Bru, не подвергавшиеся воздействию.
2. - Опыт - клетки линии CEM/Bru после воздействия устройства "Лотос" в режиме, описанном в тексте.
* - разведения вируссодержащей культуральной жидкости (б/р - без разведения).
** - результаты ИФА (р24), выраженные в оптической плотности (492 нм).


Таблица 1 (Б).
(Б) - линия-продуцент СЕМУШВ

Образцы

I пассаж

б\о*

1:3

1:9

1:27

1:81

Контроль1

2,565**

2,415

2,183

1,953

1,165

Опыт2

2,572

2,321

2,168

1,953

0,894 (71.9%)

IV пассаж

Контроль1

2,603

2,404

2,226

2,070

1,532

Опыт2

2,521

2,236

2,095

1,645
(77,2%)

0,644 (33,3%)

VII пассаж

Контроль1

2,514

2,330

2,257

2,158

2,009

Опыт2

2,490

2,310

2,245

2,179

1,783 (87.5%)

VII пассаж

 

1:3

1:9

1:27

1:81

1:243

Контроль1

 

2,237

2,146

1,957

1,193

Опыт2

 

2,225

2,106

1,771

0,824

1,2, *, ** - см. пояснения к таблице 1 (А).


Таблица 2.    Изучение влияния устройства "Лотос" на способность клеток СЕМ заражаться ВИЧ.

Вирусный штамм

Образец

Продолжительность развития инфекции

4 суток

10 суток

ВИЧ-1вяи

Контроль1

2,286*

2,060

Опыт2

2.428

2.137

ВИЧ-1Шв

Контроль

2,311

2,548

Опыт

2,201

2,112

1. Контроль - клетки СЕМ, не подвергались воздействию устройства.
2.   Опыт - клетки, обрабатывали перед заражением в течение 30 мин. при
комн. температуре.
* - результаты ИФА (р24), выражены в оптической плотности (образцы
вируссодержащей жидкости без разведения).
1111 -    - образцы, использованные для определения вирусного антигена в
разведениях (табл. 3).

Таблица 3. Применение метода титрования для точной оценки уровня развития инфекции в контрольных и опытных образцах клеток СЕМ, зараженных штаммом ВИЧ-1вки после воздействия устройства (см. табл. 2).

Образец

б\р

1:3

1:9

1:27

1:81

4 суток

Контроль1

2,311

0,703

0,363

0,208

0,166

Опыт2

2,201

0,682

0,344

0,188

0,241

10 суток

Контроль1

2,548

2,350

2,211

2,070

1,528

Опыт2

2,112

1,986

1,771

0,960

0,318

Таблица 4. Оценка биологической активности вирусного потомства, выращенного в клетках СЕМ, подвергавшихся воздействию устройства перед заражением, штамм вич-ibru.

Обоазец

1:3

1:9

1:27

1:81

4 суток

К

2.371

2.290

2,270

2,084

О

2,043

1,912

1,448

0,674

7 суток

К

2,084

2,103

2,118

2,039

О

2,151

2,171

2,131

2,093

К -  вируссодержащая жидкость контрольного образца, после 10 суток инфекции, использованная для заражения клеток СЕМ.
О -  вируссодержащая жидкость опытного образца после 10 суток инфекции, использованная для заражения клеток СЕМ.

Таблица 5. Изучение влияния устройства «Лотос» на репликацию ВИЧ в клетках СЕМ, зараженных с различной множественностью инфекции (0,1; 0,01; 0,001) и подвергавшихся первичному воздействию на этапе адсорбции.

Штамм вируса

Образец

4 суток

10 суток

0,1

0,01

0,001

0,1

0,01

0,001

ВИЧ-1 bru

Контроль

2,526

2,402

2,172

2,468

2,396

1,855

Опыт

2,526

2,340

2,006

2,383

2,034

2,164

ВИЧ-1шв

Контроль

2,442

1,972

2,283

2,230

1,643

2,106

Опыт

2,382

2,118

2,293

2,483

1,467

2,040

11111- образцы  использованные для определения вирусного антигена в разведениях (табл. 6)

схема

Таблица 6.

Титрование контрольного и опытного образца клеток СЕМ зараженных штаммом ВИЧ-1BRU  (см. табл.5).

Образец

множественность заражения 0,01

б\о

1:3

1:9

1:27

1:81

4 суток

К

2,402

1.999

1,188

0.550

0,286

О

2,340

1,429

0.711

0.351

0.379

10 суток

К

2.396

2,438

2.356

2.298

2,126

О

2,034

2,432

2,384

2,244

1,976

 

Таблица 7.

Оценка биологической активности вирусного потомства, выращенного в клетках СЕМ, при воздействии устройства в начале заражения (пггамм ВИЧ-1вки м.з. 0,01)

Образец

б\п

1:3

1:9

1:27

1:81

4 суток

К

2542

2.425

2.314

2254

2.046

О

2.643

1.474

0.665

0.359

0.267

10 СУТОК

К

2.116

2.135

2.131

2.034

О

-

2,175

2.191

2.169

2.146

К -   вируссодержащая жидкость 10 - суточной инфекции без
воздействия, использованная для заражения клеток линии СЕМ.
О -  вируссодержащая жидкость 10 - суточной инфекции после 4-кратного воздействия, использованная для заражения клеток СЕМ.


Таблица   8.   Активность   синцитиеобразования   при
сокультивации зараженных клеток после 10 суток инфекции и 4-кратного воздействия устройства с незаряженными клетками линии Sup-TI.


Штамм  вируса

образец

Множественность заражения

0,1

0,01

0,001

ВИЧ-1 bru

К

150*

162

164

О

100

20 (12,3%)

11(6,7%)

ВИЧ-1 ШВ

К

51

12

7

0

56

2 (16,7%)

0

клетки от 10-суточной инфекции контрольных образцов, клетки от 10-суточной инфекции опытных образцов, количество синцитиев на весь объем лунки 96-луночного планшета.